His标签蛋白纯化填料（带柱子）

2-8℃

避免冷冻。

一年

1.离心机
2.振荡器
3.涡旋混匀器
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒

1.纯水

1.离心管
2.吸头

1.样品中不能含有β-巯基乙醇、DTT和EDTA、EGTA等。
2.整个纯化过程中切忌凝胶脱水变干。
3.为提高纯化效率，首先确定Binding Buffer和Elution Buffer中咪唑的使用浓度。必要时可以使用线性或梯度浓度的咪唑浓度，Binding Buffer的范围为0-10 mM，洗脱缓冲液的范围为10-500 mM来进行。并通过SDS-PAGE或Western Blotting来检测目的蛋白的纯度。
4.请使用高纯度的试剂配制缓冲液，并通过0.22 μm或者0.45 μm过滤器过滤。为避免柱子被堵塞，建议将裂解液进行离心，或者使用0.22 μm或者0.45 μm过滤器过滤。
5.柱再生时，保证每步洗完后都要用足够的去离子水冲洗至中性。

填料参数：
填料体积： 10 ml
动态吸附量： 20 mg 6×His 标签蛋白（27 kD）/ml 介质
球形基质： 4 %交联度琼脂糖
平均粒径： 90 μm （45‐165 μm）
储存溶剂： 1× PBS（含20%乙醇）

天然条件下纯化多聚标签蛋白
缓冲液配制
用于配制缓冲液的水和化学试剂必须是高纯度的，并建议使用前用0.45 μm 滤膜过滤一遍。
平衡缓冲液：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，用NaOH 调pH 为8.0
洗涤缓冲液：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，10 mM 咪唑，用NaOH 调pH 为8.0
洗脱缓冲液：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，250 mM 咪唑，用NaOH 调pH 为8.0

组装层析柱
1． 将Ni-Agarose Resin填料混匀后加入层析柱，室温静置10分钟，待凝胶与溶液分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出。
2． 向装填好的柱中加入5倍柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净后，再用10倍柱体积的Binding Buffer平衡柱子，平衡结束后即可上样。

可溶性蛋白的纯化
以下以可溶性蛋白纯化为例，使用时以实际样本为准。

1． 收集菌体后，每100 mg菌体（湿重）加入1-5 ml细菌裂解液（每1 ml 细菌抽提试剂中已加入10 μl 蛋白酶抑制剂混合物），超声裂解菌体。
2． 10000 rpm,4℃离心3分钟，收集上清中的可溶性蛋白。
3． 用Binding Buffer将菌体裂解液等倍稀释后负载上柱，流速为10倍柱体积/小时，收集流穿液。
4． 使用15倍柱体积的Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白。
5． 使用适量Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。
6． 洗脱后，依次使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡（乙醇要将填料浸没），封柱后2-8℃保存。

柱再生
当填料使用多次后，结合效率会有所下降（表现为流速变慢或填料失去蓝绿色），可以用以下方法再生，提高填料的使用寿命和蛋白质的结合效率。
1． 使用2倍柱体积的6 M盐酸胍冲洗后，使用3倍柱体积的去离子水冲洗。
2． 使用1倍柱体积的2% SDS冲洗。
3． 依次使用1倍柱体积的25%、50%、75%和5倍柱体积的99%乙醇冲洗，再依次使用1倍柱体积的75%、50%和25%的乙醇冲洗。
4． 使用1倍柱体积的去离子水冲洗。
5． 使用5倍柱体积含50 mM EDTA缓冲液（PH8.0）冲洗。
6． 使用3倍柱体积去离子水，3倍柱体积20%乙醇冲洗。
7． 置2-8°C保存。
8． 再次使用前，需首先使用10倍柱体积去离子水冲洗，然后使用5个柱体积的50 mM NiSO4再生，3个柱体积的Binding Buffer平衡。
9． 为了长时间的保存，介质应当2‐8 ℃保存在1× PBS（含20 % 乙醇）中。

His标签蛋白纯化过程，经常出现的问题包括几个方面：
1、 纯化的组分中没有His标签的蛋白?
2、 HIS标签蛋白洗脱后杂带较多?
我们可以根据检测上柱前蛋白，流穿液蛋白，和洗脱液蛋白的检测，来进行基本的判断。是否包涵体蛋白？是否标签没有表达出来：可能是因为折叠构象不正确导致标签在重折叠时没有位于蛋白质分子的表面上无法与离子柱结合；或者标签在折叠时没有位于蛋白质分子的表面上；蛋白不溶解或沉淀在柱子上：要留意缓冲液体的pH，此外在样品中添加一些表面活性剂甚至乙醇等有机溶剂可以增加疏水性蛋白的溶解度，对于带半多的蛋白很容易氧化聚集沉淀，所以需要加2-5mM巯基乙醇避免沉淀。