线粒体、溶酶体、外泌体的提取均属于亚细胞结构或胞外囊泡的分离纯化技术，因各自的结构特性、存在环境差异，提取过程中需重点控制纯度、完整性及活性(或功能性)，以下是三类物质提取的核心注意事项：
线粒体提取注意事项
线粒体是胞内双层膜细胞器，提取核心是分离线粒体与细胞质、细胞核等成分，同时避免膜结构破裂导致功能丧失。
样品处理与前期准备
全程低温操作(0-4℃)，抑制线粒体酶活性丧失及结构降解，所有试剂、离心管、研磨器材需提前冰上预冷。
样品需新鲜：细胞或组织样品采集后立即处理，避免常温放置；组织样品需在液氮中快速研磨成粉末，加入预冷的线粒体分离缓冲液(含蔗糖等渗透压调节剂)，防止线粒体因渗透压失衡破裂。
加入保护剂：在缓冲液中添加蛋白酶抑制剂(避免线粒体蛋白降解)和抗氧化剂(如谷胱甘肽，减少活性氧对线粒体的损伤)。
分离与纯化过程
控制破碎强度：细胞破碎需采用温和方式(如玻璃匀浆器手动匀浆、低功率超声)，避免过度破碎导致细胞核、溶酶体破裂污染，同时确保线粒体完整释放。破碎后可通过光学显微镜观察，确保大部分细胞破碎且线粒体形态正常。
梯度离心参数精准：线粒体分离常用差速离心法，需严格控制离心转速和时间(如先低速离心去除细胞碎片和细胞核，再高速离心收集线粒体沉淀)，后续可通过密度梯度离心(如蔗糖梯度、 Percoll 梯度)进一步纯化，去除细胞质蛋白和其他细胞器污染。
避免反复冻融：收集的线粒体沉淀需用预冷的保存缓冲液重悬，短期 4℃保存(不超过 24 小时)，长期需分装后 - 80℃冻存，禁止反复冻融破坏膜结构。
纯度与活性验证
纯度检测：通过 Western Blot 检测标志物，线粒体阳性标志物(如细胞色素 c 氧化酶 IV、线粒体热休克蛋白 60)，阴性标志物(如核蛋白标志物组蛋白 H3、细胞质蛋白标志物 GAPDH)，确保无明显交叉污染。
活性验证：若需后续功能实验，需检测线粒体呼吸链酶活性或膜电位，确认提取的线粒体保持生物学活性。
溶酶体提取注意事项
溶酶体是含酸性水解酶的单层膜细胞器，提取关键是维持其酸性环境和膜稳定性，避免水解酶释放导致自身降解及样品污染。
样品与试剂准备
缓冲液选择：使用含酸性调节剂(如柠檬酸 - 磷酸缓冲液，pH 4.5-5.5)和渗透压稳定剂(如甘露醇、蔗糖)的专用缓冲液，模拟溶酶体内酸性环境，防止膜破裂。
抑制剂添加：除蛋白酶抑制剂外，需加入溶酶体酶抑制剂(如氟化钠、焦磷酸钠)，抑制溶酶体内部水解酶活性，避免其释放后降解其他蛋白或自身结构。
样品新鲜度：细胞或组织需即时处理，溶酶体对温度敏感，常温下易破裂，全程严格低温操作。
分离纯化关键步骤
温和破碎细胞：采用手动匀浆或低强度超声破碎，避免高压导致溶酶体膜破裂，破碎后尽快离心分离，减少水解酶暴露时间。
优化离心方案：通过差速离心初步分离后，采用密度梯度离心(如蔗糖梯度离心，浓度梯度 15%-40%)纯化，溶酶体因密度较高会处于特定梯度层，需精准收集目标层。
避免 pH 波动：所有操作中避免缓冲液与碱性溶液接触，防止 pH 升高破坏溶酶体膜稳定性，收集的溶酶体沉淀需用酸性保存缓冲液重悬。
质量验证与保存
纯度检测：检测溶酶体标志物(如酸性磷酸酶、组织蛋白酶 D)，排除线粒体、细胞核等杂质污染。
保存条件：短期 4℃保存不超过 12 小时，长期需分装后 - 80℃冻存，且需加入足量酶抑制剂，解冻后尽快使用。
外泌体提取注意事项
外泌体是细胞分泌的纳米级胞外囊泡(直径 30-150nm)，提取核心是提高回收率，同时去除蛋白 aggregates、脂蛋白等杂质。
样品预处理
样品选择：常用细胞培养液、血清、血浆、尿液等，血清 / 血浆样品需先去除凝血因子和细胞碎片(5000g 离心 10 分钟)，避免干扰后续分离。
避免污染：所有器材需灭菌处理，细胞培养液需使用无外泌体血清(通过超速离心预处理去除血清中的外泌体)，防止外源囊泡污染。
提取方法与操作细节
方法适配：根据样品类型选择试剂盒(如聚合物沉淀法、超速离心法、免疫亲和法)，聚合物沉淀法操作简便但纯度较低，超速离心法纯度高但对设备要求高，免疫亲和法特异性强但产量较低。
超速离心参数：若采用超速离心法，需严格控制转速和时间(如先 10000g 离心 30 分钟去除大颗粒杂质，再 100000-120000g 离心 70-90 分钟收集外泌体沉淀)，离心过程中保持温度 4℃，避免囊泡结构破坏。
避免反复离心：多次高转速离心可能导致外泌体破裂，沉淀重悬时需用预冷的 PBS 缓慢吹打，避免剧烈振荡。
纯度验证与保存
纯度检测：通过透射电镜观察外泌体典型杯状结构，纳米颗粒追踪分析(NTA)检测粒径分布，Western Blot 检测外泌体标志物(如 CD63、CD81、TSG101)。
保存条件：短期 4℃保存不超过 3 天，长期需分装后 - 80℃冻存，加入蛋白酶抑制剂，避免反复冻融导致囊泡破裂和蛋白降解。
