在细胞生物学、肿瘤学、药理学等领域的研究中，细胞功能检测是揭示细胞生理状态、病理机制及药物作用效果的核心手段。细胞周期、增殖、活性、缺氧状态、活性氧水平及耗氧率等指标，从不同维度反映了细胞的代谢活性、生长状态及应激反应。本文将系统梳理这六种关键检测技术的原理、操作要点及应用场景，为科研工作者提供全面的技术参考。
一、细胞周期检测
细胞周期是细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，包括 G1 期、S 期、G2 期和 M 期，其进程异常与肿瘤发生、细胞分化障碍等疾病密切相关。
(一)检测原理
常用碘化丙啶(PI)染色法，PI 可嵌入 DNA 双链中，其荧光强度与 DNA 含量成正比。通过流式细胞仪分析荧光信号，可将处于不同周期时相的细胞区分开：G1 期细胞含二倍体 DNA，荧光强度呈单峰；S 期细胞处于 DNA 合成阶段，荧光强度介于 G1 期和 G2/M 期之间；G2/M 期细胞含四倍体 DNA，荧光强度为 G1 期的两倍。
(二)操作要点
样品制备：收集对数期细胞，用 PBS 洗涤 2 次，加入 70% 冰乙醇固定，4℃孵育过夜。
染色处理：离心去除固定液，PBS 洗涤后，加入 PI 染色液(含 RNase A，避免 RNA 干扰)，室温避光孵育 30 分钟。
检测分析：通过流式细胞仪检测，采用 ModFit 软件分析各周期时相细胞的比例。
(三)应用场景
主要用于研究细胞增殖调控机制、肿瘤细胞周期阻滞药物的筛选，以及细胞分化过程中周期进程的变化。
二、细胞增殖检测
细胞增殖检测用于评估细胞的生长能力，是判断细胞活力、药物细胞毒性及生长因子作用效果的重要指标。
(一)常用方法及原理
CCK-8 法：CCK-8 试剂中的 WST-8 在细胞内脱氢酶作用下生成橙色甲臜染料，染料产量与活细胞数量成正比，通过酶标仪检测 450nm 处吸光度值，反映细胞增殖水平。
EdU 掺入法：EdU 是胸腺嘧啶类似物，可在 S 期掺入新合成的 DNA 中，通过荧光标记的 EdU 抗体检测荧光信号，直接反映处于增殖期的细胞比例。
(二)操作要点
CCK-8 法：将细胞接种于 96 孔板，培养至设定时间点，加入 CCK-8 试剂，继续孵育 1-4 小时，检测吸光度值。需设置空白对照组，排除试剂本身的吸光干扰。
EdU 掺入法：细胞培养时加入 EdU 工作液，孵育 2-24 小时(根据细胞周期调整)，固定细胞后进行通透处理，加入荧光标记抗体孵育，荧光显微镜观察或流式细胞仪定量。
(三)应用场景
广泛应用于药物筛选(评估药物对细胞增殖的抑制或促进作用)、细胞毒性检测、干细胞增殖能力评估等领域。
三、细胞活性检测
细胞活性检测旨在判断细胞的存活状态，区分活细胞与死细胞，常用于评估实验处理对细胞的损伤程度。
(一)核心方法及原理
台盼蓝染色法：台盼蓝是细胞活性染料，活细胞细胞膜完整，染料无法进入；死细胞细胞膜破裂，染料进入后使细胞呈蓝色，通过显微镜计数活细胞与死细胞比例。
钙黄绿素 - AM / 碘化丙啶(Calcein-AM/PI)双染色法：Calcein-AM 可被活细胞内的酯酶水解生成绿色荧光物质，PI 仅能进入死细胞染色 DNA 呈红色，通过荧光显微镜或流式细胞仪同时区分活细胞和死细胞。
(二)操作要点
台盼蓝染色法：取细胞悬液与台盼蓝染液按比例混合，室温静置 5 分钟，显微镜下计数 200 个以上细胞，计算活细胞率。
双染色法：细胞接种于培养皿或 96 孔板，加入染色液孵育 15-30 分钟，避光条件下观察荧光信号，绿色荧光为活细胞，红色荧光为死细胞。
(三)应用场景
适用于细胞培养过程中的活力监测、药物或毒素对细胞的损伤评估、细胞分离纯化后的活性检测等。
四、细胞缺氧检测
细胞缺氧是多种生理和病理过程中的重要微环境特征，如肿瘤组织、缺血性疾病病灶等，缺氧检测可精准反映细胞所处的氧环境状态。
(一)检测原理
采用缺氧特异性探针(如 pimonidazole hydrochloride)，该探针在缺氧条件下(氧分压 < 10mmHg)可被细胞内的还原酶还原，生成能与细胞内蛋白结合的产物，通过免疫荧光或免疫组织化学方法检测结合产物，即可标记缺氧细胞。
(二)操作要点
细胞水平检测：将缺氧探针加入细胞培养液，在设定的缺氧条件下培养 2-4 小时，固定细胞后进行通透处理，加入荧光标记的特异性抗体孵育，荧光显微镜观察或流式细胞仪定量。
组织水平检测：将探针通过尾静脉注射入动物体内，一段时间后取目标组织，制作石蜡切片，通过免疫组化染色检测缺氧区域。
(三)应用场景
主要用于肿瘤微环境研究、缺血性心脏病及脑卒中的病理机制探讨，以及缺氧靶向药物的研发与效果评估。
五、活性氧检测
活性氧(ROS)是细胞代谢过程中产生的含氧活性物质，过量 ROS 会导致氧化应激损伤，与衰老、肿瘤、神经退行性疾病等密切相关。
(一)检测原理
利用 ROS 特异性荧光探针(如 DCFH-DA、DHE)，探针进入细胞后，被 ROS 氧化生成具有荧光活性的物质，荧光强度与 ROS 水平正相关。DCFH-DA 可检测总 ROS，DHE 主要检测超氧阴离子。
(二)操作要点
细胞接种于培养板，培养至对数期，加入荧光探针工作液，37℃孵育 20-30 分钟。
用 PBS 洗涤细胞 3 次，去除未进入细胞的游离探针，加入新鲜培养液，通过荧光显微镜观察荧光强度，或用酶标仪 / 流式细胞仪定量检测。
(三)应用场景
适用于氧化应激相关疾病的机制研究、抗氧化药物的筛选与效果评估、环境毒素对细胞的氧化损伤检测等。
六、耗氧率检测
耗氧率是反映细胞线粒体呼吸功能的核心指标，直接体现细胞的能量代谢水平，对研究线粒体功能障碍相关疾病具有重要意义。
(一)检测原理
采用 Seahorse XF 细胞能量代谢分析仪，该设备通过检测细胞培养液中氧气浓度的实时变化，计算细胞的耗氧率。仪器配备专用培养板，可在不干扰细胞培养的情况下进行动态监测。
(二)操作要点
细胞接种于 Seahorse 专用培养板，培养至细胞融合度达 70%-80%，更换为无血清无碳酸氢盐的检测培养液，37℃无 CO₂环境下平衡 1 小时。
设定检测程序，加入线粒体呼吸链抑制剂(如寡霉素、 FCCP、抗霉素 A 等)，通过分析抑制剂作用前后的耗氧率变化，区分基础耗氧率、ATP 耦合耗氧率及最大耗氧率。
(三)应用场景
常用于线粒体功能评估、代谢相关疾病(如糖尿病、肥胖症)的机制研究、药物对细胞代谢的调控作用分析等。
