蛋白提取是分子生物学和生物化学研究中的基础操作，不同定位的蛋白(总蛋白、核蛋白、膜蛋白)因结构和存在部位差异，提取方法有所不同，以下结合试剂盒的标准化操作流程及关键注意事项详细说明：
总蛋白提取：总蛋白提取旨在获取细胞或组织中所有蛋白，适用于大多数蛋白定性、定量及后续电泳、免疫印迹等实验。
实验前准备
试剂预处理：取出试剂盒中的裂解液，按比例加入蛋白酶抑制剂(避免蛋白降解)和磷酸酶抑制剂(如需保留磷酸化蛋白)，冰上预冷。
样品处理：细胞样品经 PBS 洗涤 2 次，去除培养基残留；组织样品需在液氮中研磨成粉末，避免常温下蛋白降解。
提取步骤
加样裂解：向细胞沉淀或组织粉末中加入预冷的裂解液(每 10^6 个细胞加 100-200μL，每 10mg 组织加 200-300μL)，涡旋振荡 10-15 秒，冰上静置 30 分钟，期间每 10 分钟涡旋一次，充分裂解细胞。
离心分离：4℃、12000-15000g 离心 10-15 分钟，取上清液，即为总蛋白提取液。
关键注意事项
全程保持低温操作(0-4℃)，抑制蛋白酶活性。
裂解液需与样品充分混合，避免局部浓度过高影响裂解效果。
离心后避免触碰沉淀(含细胞碎片、核酸等杂质)，确保上清纯度。
核蛋白提取：核蛋白位于细胞核内，提取需先分离细胞核与细胞质，再裂解核膜释放核蛋白，核心是避免细胞质蛋白污染。
实验前准备
试剂预处理：核蛋白试剂盒通常含细胞质裂解液(低渗缓冲液)和核裂解液，均需加入蛋白酶 / 磷酸酶抑制剂，冰上预冷。
样品处理：细胞经 PBS 洗涤后，离心收集沉淀，避免反复吹打损伤细胞核。
提取步骤
细胞质分离：向细胞沉淀中加入预冷的细胞质裂解液，冰上孵育 10-15 分钟，期间轻轻弹击管壁数次，使细胞膜破裂。4℃、5000g 离心 5 分钟，收集上清液(细胞质蛋白)，保留沉淀(细胞核)。
细胞核洗涤：向细胞核沉淀中加入少量细胞质裂解液，轻轻吹打洗涤，离心后弃上清，去除残留的细胞质蛋白。
核蛋白裂解：向洗涤后的细胞核沉淀中加入核裂解液，冰上孵育 20-30 分钟，期间频繁涡旋振荡，促进核膜破裂。4℃、12000g 离心 10 分钟，取上清液，即为核蛋白提取液。
关键注意事项
细胞质裂解液孵育时间需严格控制，避免过度裂解导致细胞核破裂，引发细胞质蛋白污染。
细胞核洗涤步骤不可省略，可根据污染情况重复 1-2 次。
核裂解液黏度较高，离心后需快速吸取上清，避免沉淀复溶。
膜蛋白提取：膜蛋白镶嵌或附着于生物膜上，含大量疏水结构域，常规裂解液难以溶解，需借助去垢剂(如 Triton X-100、SDS 等)破坏膜结构。
实验前准备
试剂预处理：膜蛋白试剂盒的裂解液含特定比例的去垢剂(兼顾溶解膜蛋白与保持蛋白活性)，加入抑制剂后冰上预冷。
样品处理：细胞或组织样品需充分破碎(如超声破碎仪处理细胞，组织研磨时加入石英砂)，暴露细胞膜结构。
提取步骤
加样裂解：向破碎后的样品中加入膜蛋白裂解液，冰上孵育 40-60 分钟，期间每 15 分钟涡旋一次，使去垢剂充分作用于膜结构。
离心纯化：4℃、10000g 离心 10 分钟，去除未破碎的组织或细胞碎片；取上清液再次 4℃、15000g 离心 20 分钟，进一步去除杂质，最终上清即为膜蛋白提取液。
关键注意事项
去垢剂浓度需严格遵循试剂盒说明，过高可能导致蛋白变性，过低则无法有效溶解膜蛋白。
样品破碎程度直接影响提取效率，需根据样品类型调整破碎参数(如超声功率、研磨时间)。
膜蛋白提取后需尽快进行后续实验，避免去垢剂失效导致蛋白沉淀。
