-S转移酶（GSH-ST）检测试剂盒

2-8℃ 避光

开盖后组份按要求条件保存。

6个月

血清血浆/组织/细胞

1.分光光度计
2.恒温水浴锅
3.漩涡混匀器
4.离心机
5.移液器
6.冰箱
7.冰盒

1.纯水
2.无水乙醇

1.离心管
2.吸头

1.管子要洗干净，先用温肥皂水刷净，再用自来水冲洗20遍以上，最后用纯水过1-2次后烘干即可；
2.试剂B配制时要加热充分溶解（温度可达90-100℃）；
3.肝素抗凝全血放置冰箱存放时间不可超过3天，血浆、组织块放-20℃可保存一个月；
4.试剂A配成储备液后，冰箱冷藏至少可保存一个月；
5.1mmol/L的GSH底物现配现用；
6.上清液当天提取当天测定；
7.样品前处理参照实验方法学部分；

试剂配制
1. 试剂A1的配制：
使用前将A1粉剂加1ml无水乙醇充分溶解2-8℃保存。
2. 试剂A工作液配制：
使用前将配制好的试剂A1：A2按1:59的比例进行配制，现配现用；
3. 试剂B工作液配制：
使用前将粉剂B1加90~100℃的热纯水170ml，充分溶解，将配制好的B1和B2两种溶液充分混匀，得到的为过饱和溶液，室温保存；如果出现结晶，直接取上清进行实验；
4. 试剂C工作液配制：
加纯水200ml，充分溶解后，室温保存；可以保存在赠送的塑料瓶中。
5. 试剂D工作液配制：
加纯水50ml，充分溶解后，2-8℃避光保存；
6. 试剂F工作液配制：
将试剂F：标准溶剂储备液：纯水=1:9的比例10倍稀释；
7. 标准品的配制：
1mmol/L的GSH标准溶液的配制：取3.07mg的GSH标准品一支加到已配好的试剂F工作液10ml中混匀溶解；
20umol/L的GSH标准溶液的配制：取1mmol/L的GSH标准溶液0.2ml加试剂F工作液9.8ml中混匀溶解；
8. 基质液的配制：
试剂A工作液与1mmol/L的GSH标准溶液以1:1混合。

操作步骤：；

(一)、样本前处理
1. 50倍稀释的溶血液的配制：取肝素抗凝全血20ul，以纯水稀释至1ml，混匀，放置5min进行测定；配制好的溶血液要在1小时内测定完，否则影响酶活力；抗凝全血若当天来不及测定可冰箱2-8℃保存，2-3天内酶活力变化不大；
2. 组织匀浆的制备;
（1）取组织块（0.2-1g）最少可到2-5mg，在冷的生理盐水中漂洗，去除血液，擦拭干，称重，放入5或10ml的小烧杯中；
（2）加入预冷的匀浆介质（ph7.4的0.01mol/L Tris-Hcl，0.0001mol/L EDTA-2Na，0.01mol/L蔗糖0.8%的氯化钠溶液）或者用0.86%冷生理盐水，加入的体积总量为组织块重量的9倍。将组织块尽可能的剪碎。
（3）机械匀浆：用组织捣碎机10000-15000r/min 上下研磨制成10%匀浆。
（4）将制备好的10%匀浆用普通离心机或低温低速离心机3000r/min左右离心10-15min，取上清待测；
3. 线粒体及微粒体的制备：
（1）制备10%组织匀浆（制备方法同上）；
（2）制备线粒体：取10%组织匀浆，用普通离心机或低温低速离心机以1000-2000r/min离心10min，取上清以8000-10000r/min（低温高速离心机）离心15min，沉淀即为线粒体；
（3）制备微粒体：取分离线粒体后的上清液，以144000g离心30min，沉淀为即为微粒体；
（4）将分离的线粒体或微粒体分别用冰冷的匀浆介质制备成混悬液，机械或手工匀浆使其破碎，待测酶活力；也可反复冻融使其破碎，但有部分酶活会受影响。
4. 血清、血浆可直接取样；

（二）、血清样本操作表
计算公式：
1. 血清GST活力单位定义：
每毫升血清（浆）在37℃的反应1min，扣除非酶促反应，使反应体系中GSH浓
度降低1umol/L为1个酶活力单位；

2. 计算公式：

血清（浆）GST活力 = 对照OD值–测定OD值X 标准品浓度 X 反应体系稀释÷ 反应时间
（U/ml） 标准OD值-空白OD值 （20umol/L） 倍数（6倍） （30min）


÷ 样本取样量（0.1ml）

（二）、组织样本操作表
酶促反应：
显色反应：
计算公式：
1. 组织样本GST活力单位定义：
每毫克组织蛋白在37℃的反应1min，扣除非酶促反应，使反应体系中GSH浓
度降低1umol/L为1个酶活力单位；

2. 计算公式：

组织中GST活力 = 对照OD值–测定OD值X标准品浓度 X反应体系稀释÷反应时间÷取样量
（U/mgprot） 标准OD值-空白OD值 （20umol/L） 倍数（6倍） （10min）（0.1ml）

÷ 待测样本蛋白浓度
（mgprot/ml）

【注】：mgprot/ml表示蛋白浓度为毫克蛋白/毫升。

（三）50倍稀释溶血液样本检测：
酶促反应：
显色反应：

计算公式：
1. 全血中GST活力单位定义：
每毫升全血在37℃的反应1min，扣除非酶促反应，使反应体系中GSH浓
度降低1umol/L为1个酶活力单位；

2. 计算公式：

全血GST活力 = 对照OD值–测定OD值X 标准品浓度 X 反应体系稀释÷ 反应时间
（U/ml） 标准OD值-空白OD值 （20umol/L） 倍数（6倍）（30min）


÷ 全血取样量（0.004ml）