细胞转染试剂盒（磷酸钙法）

-20℃保存

注意微生物污染

6个月

1. 离心机
2. 移液器
3. 冰箱
4. 冰盒

1.PBS缓冲液 2.HBSS

1. 离心管
2. 吸头
3. 一次性手套

1. 注意无菌操作，尽量避免污染。
2. DNA不应含有蛋白和酚。
3. 休克处理某些细胞系会使转染效率大大提高，但应注意甘油暴露过久易导致细胞死亡。
4. 转染12～24h后，可以加入终浓度为10mmol/L的丁酸钠溶液，可以提高病毒滴度。
5. BBS Solution的pH值直接关系到转染效率，尽量避免长时间暴露在空气中，以免被空气中的二氧化碳酸化。
6. 转染时，把DNA-氯化钙溶液加入到BBS溶液中，不要把BBS溶液加入到DNA-氯化钙溶液中。
7. 高纯度的质粒是获得高转染效率的必要条件，要确保A260/A280大于1.8，并且电泳检测抽提到的质粒90%以上都是超螺旋。
8. 在用磷酸钙法转染细胞时应使用浓度不高于5%的二氧化碳，二氧化碳的浓度为3%左右。
9. 转染时由于质粒不同、细胞不同，的质粒用量需自行摸索。

贴壁细胞转染：
1. 在转染前24h用消化培养细胞，取适量对数期细胞转移至新的培养器皿中，待细胞密度大70～80%满时即可进行转染。后续操作步骤均按6孔板计算，如果转染器皿不同，请按比例自行调节用量。
2. 在加入DNA之前2～4h，加入2ml不含抗生素的培养液，置于37℃ 5% CO2培养箱培养。
3. 取DNA(体积不宜超过20μl)加入100μl Calcium chloride solution，混匀，即为DNA-CaCl2溶液。
4. 取BBS solution 100μl，用移液器一边吹打BBS solution，一边逐滴加入DNA-CaCl2溶液(操作缓慢，一般在1～2min)。
5. 室温静置20～30min，即为DNA-CaCl2-BBS溶液，此时可能出现极其微小颗粒沉淀。
6. 取DNA-CaCl2-BBS溶液底部物质均匀加入到6孔板细胞中，轻轻晃动混匀。
7. 置于37℃ 5% CO2培养箱培养。
8. 去除培养液，用PBS清洗细胞2次，加入2ml培养液继续培养，一般24h后可见转染细胞的表达。

悬浮细胞转染：
1. 低速离心收集悬浮细胞，用PBS洗涤1次。
2. 取DNA(体积不宜超过20μl)加Calcium chloride solution，混匀，即为DNA-CaCl2溶液。
3. 取BBS solution，用移液器一边吹打BBS solution，一边逐滴加入DNA-CaCl2溶液。
4. 室温静置，即为DNA-CaCl2-BBS溶液，此时可能出现极其微小颗粒沉淀。
5. 每106个细胞沉淀用100μl DNA-CaCl2-BBS溶液重新悬浮室温放置。
6. 6孔板每孔加入2ml不含抗生素的培养基，取DNA-CaCl2-BBS溶液底部物质均匀加入到6孔板中，轻轻晃动混匀。
7. 置于37℃ 5% CO2培养箱培养，去除培养液，用PBS清洗细胞2次，加入2ml培养液继续培养，一般24h后可见转染细胞的表达。