囊泡是由细胞膜包裹形成的微小膜性结构，广泛存在于生物体液(血液、尿液、脑脊液)及培养液中，根据来源可分为外泌体(30-150nm)、微囊泡(100-1000nm)和凋亡小体(50-2000nm)。其内含DNA、RNA、蛋白质等生物活性物质，在疾病诊断、药物递送等领域具有重要价值。本文系统阐述从样本采集到最终产物鉴定的完整技术链条。
一、前期准备与样本处理
1. 材料选择原则
- 生物源性样本：优先选用新鲜未溶血血浆(抗凝剂推荐枸橼酸钠)，避免使用EDTA可能干扰后续质谱分析。细胞培养上清需提前4℃静置去除死细胞碎片。
- 合成型囊泡：通过基因编辑细胞系构建，注意添加无外泌体血清替代品。
- 特殊样本：脑脊液需经蔗糖梯度预纯化，尿液样本应浓缩处理。
2. 预处理关键步骤
- 初步澄清：将原始样本以300×g离心10分钟去除完整细胞；再以2000×g离心20分钟清除凋亡体。
- 过滤除菌：采用0.8μm滤膜截留大颗粒杂质，保留小于该孔径的目标囊泡。
- 浓缩富集：对于低丰度样本，可先用超滤管(MWCO 10kDa)进行体积缩减。
二、质量控制体系构建
1. 表征分析组合拳
- 粒径分布：纳米粒子追踪仪(NTA)显示峰值应在标称范围内，PDI<0.2表明均一性好。
- 形态观察：透射电镜下可见典型杯状凹陷结构，冷冻蚀刻技术揭示膜层数。
- 标志物验证：Western blot检测CD63、TSG101阳性，Calnexin阴性排除内质网污染。
- 功能检测：荧光染料标记示踪显示被靶细胞摄取效率>60%。
三、进阶优化策略
1. 产量提升技巧
- 刺激诱导分泌：对肿瘤细胞施加缺氧/辐射应激，可使囊泡释放量提高5-8倍。
- 连续收集模式：每48小时更换一次培养基，累计收获周期延长至7天。
- 切向流过滤系统：配备中空纤维膜包，实现动态连续置换缓冲液。
2. 纯度强化方案
- 双抗体夹心法：先用过抗CD9抗体包被磁珠捕获泛囊泡，再用EpCAM抗体二次筛选特定亚群。
- 仿生亲和层析：修饰琼脂糖珠表面为磷脂双层膜，模拟天然相互作用捕获目标囊泡。
- 电荷排斥层析：利用肝素琼脂糖柱吸附带负电的杂蛋白，流出相富集目标囊泡。
四、储存运输规范
- 短期保存：4℃条件下不超过72小时，置于硅烷化EP管减少吸附损失。
- 长期存储：分装后-80℃冻存，禁止反复冻融超过3次。推荐添加海藻糖作为冻干保护剂。
- 运输要求：冰袋维持0-4℃，全程避光防震，入境国别注意生物安全许可。
