细胞凋亡是一个有序的生理过程，其早期会发生磷脂酰丝氨酸（PS）外翻—— 正常情况下位于细胞膜内侧的 PS 翻转到外侧，这是凋亡早期的标志性事件。
- Annexin V：一种钙依赖性磷脂结合蛋白，可高特异性、高亲和力地与膜外 PS 结合，通过荧光标记（如 FITC，异硫氰酸荧光素）实现对凋亡早期细胞的识别。
- PI（碘化丙啶）：一种核酸染料，无法透过完整细胞膜，但可进入膜破损的细胞（如凋亡晚期细胞或坏死细胞），与 DNA 结合发出红色荧光，用于区分凋亡晚期 / 坏死细胞与活细胞、凋亡早期细胞。
通过双染后流式细胞术或荧光显微镜检测，可将细胞分为四类：
- 活细胞：Annexin V⁻/PI⁻（无荧光）
- 凋亡早期细胞：Annexin V⁺/PI⁻（仅绿色荧光）
- 凋亡晚期细胞：Annexin V⁺/PI⁺（绿色 + 红色荧光）
- 坏死细胞：Annexin V⁻/PI⁺（仅红色荧光，膜完整性早于凋亡被破坏）
- Annexin V-FITC：荧光标记的 Annexin V，通常溶于含防腐剂的缓冲液中，避光保存。
- PI 染色液：高浓度 PI 溶液（需稀释使用），具有潜在毒性和诱变作用，操作时需注意防护。
- Binding Buffer：含钙离子的缓冲液，维持 Annexin V 与 PS 结合所需的离子环境，避免使用无钙缓冲液（如 PBS）替代。
- 说明书：包含具体稀释比例、染色时间、操作步骤及注意事项。
- 细胞收集：贴壁细胞需用胰酶消化（避免过度消化导致细胞膜损伤），悬浮细胞直接离心收集，用冷 PBS 洗涤 2 次以去除培养基成分。
- 洗涤与重悬：将细胞重悬于 Binding Buffer 中，调整浓度至 1×10⁶ cells/mL，确保细胞状态良好（避免机械损伤导致的假阳性）。
- 双染反应：每 100μL 细胞悬液中加入 5μL Annexin V-FITC 和 5μL PI，室温避光孵育 5-15 分钟（时间过短可能染色不充分，过长可能导致 PI 非特异性进入活细胞）。
- 检测：
- 流式细胞术：孵育后加入 400μL Binding Buffer，1 小时内上机检测，激发波长 488nm，FITC 检测通道为 FL1（绿色荧光），PI 检测通道为 FL2 或 FL3（红色荧光）。
- 荧光显微镜：滴加染色后的细胞悬液至载玻片，封片后观察，凋亡早期细胞呈绿色，凋亡晚期细胞呈黄橙色，坏死细胞呈红色。
- 基础研究：探究药物、辐射、细胞因子等对细胞凋亡的诱导或抑制作用。
- 临床检测：评估肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，监测免疫细胞的凋亡状态。
- 毒理学研究：检测化学物质或环境因素对细胞的毒性及凋亡诱导效应。
- 避光操作：FITC 和 PI 均易受光漂白，染色及孵育过程需避光，流式检测前样本需置于冰上并尽快上机。
- 钙离子依赖：Binding Buffer 中的钙离子是 Annexin V 结合 PS 的关键，若缓冲液含钙量不足，会导致染色效率下降。
- 细胞浓度：过高的细胞浓度可能导致荧光信号叠加，影响结果分析，建议调整至 1×10⁶ cells/mL 左右。
- 对照设置：需设置空白对照（未染色细胞）、单染对照（仅 Annexin V-FITC 或 PI）用于流式细胞术的荧光补偿调节。
注意事项
1.开盖前请离心。
2.开盖后组份按要求条件保存。
3.拆封后请尽快使用完！
检测方法
1.流式细胞仪
2.激光共聚焦
3.荧光显微镜
产品特点
1.方便：可用流式细胞仪或荧光显微镜检测；
2.快速：1小时内即可完成实验；
3.准确：能准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，并计数各群细胞的比例。
产品应用
1.流式细胞仪
2.激光共聚焦
3.荧光显微镜
仪器准备
1.流式细胞仪或荧光显微镜或激光共聚焦
2.离心机
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒
试剂准备
1.PBS 缓冲液（pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X））
2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）
使用注意事项
1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体损失导致试剂量不够用。
2.细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。离心力在不损失细胞的前提下尽可能小，重悬细胞是动作要轻柔，避免多次反复的激烈吹打。不用涡旋振荡器。
3.Annexin V-FITC（等）和Propidium iodide（等）是光敏物质，在操作时请注意避光，尽量减少它们暴露在光下的时间。有必要时可以使用带盖子的冰盒或铝箔纸避光。标记后将细胞保持在避光环境中。移液过程中短暂暴露在光线下（<30秒）是可以接受的。
4.由于细胞凋亡是一个快速和动态的过程，因此最好在染色后立即进行分析。
5.使用Annexin V-FITC（等） 试剂盒检测凋亡需要针对活细胞。不要固定细胞，固定操作会对结果产生干扰。
使用方法
样品染色：
1. 离心收集悬浮细胞。离心机约300×g力，2-8°C，离心时间5分钟，弃培养基。
2. 用冷PBS洗涤细胞两次。
3. 用400 μl 1X Annexin V结合液重新悬浮细胞，浓度大约为1×106 cells/ml。
4. 在细胞悬浮液中加入5 μl Annexin V-FITC染色液，轻轻混匀后于2-8°C避光条件下孵育15分钟。
5. 加入5-10 μl 7-AAD染色液后轻轻混匀于2-8°C避光条件下孵育2-5分钟。 6. 立即用流式细胞仪或荧光显微镜检测。
常见问题分析
实验过程中Annexin V染不上色或阳性率偏低。可能的原因如下：
1. 用于检测的流式细胞仪/显微镜设置不当。调整使用正确的仪器设置。
2. 确定实验中的诱导剂是否能产生凋亡。可通过设定确切凋亡诱导效果的阳性药物对照来排除这一情况。
3. 细胞未启动凋亡。重新确定诱导后凋亡启动的时间点（时程实验）。
4. 细胞数量偏少。增加细胞数量。
5. 贴壁细胞消化不当。Annexin V 跟PS 的结合需要Ca2+离子，结合液中含有Ca2+，EDTA 的消化会影响染色，建议使用无EDTA 的胰酶，或者消化后用PBS洗涤干净。
实验过程中阳性率偏高。可能的原因如下：
1. 用于检测的流式细胞仪/显微镜设置不当。调整使用正确的仪器设置。
2. 细胞本身活力太差。实验中发现未经诱导凋亡的对照细胞经染色后AnnexinV+/PI+双阳性的细胞比例过高，造成这种结果的原因可能是细胞本身活力太差。建议用台盼蓝染色计算细胞的活力，台盼蓝拒染的细胞应大于95%。若活力偏低低，建议重新复苏细胞，通常刚复苏的细胞至少要传代3 次以后才能进行实验。
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