Annexin V-FITC / PI 双染细胞凋亡

Annexin V-FITC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒说明

一、核心检测原理

• Annexin V：一种钙依赖性磷脂结合蛋白，可高特异性、高亲和力地与膜外 PS 结合，通过荧光标记（如 FITC，异硫氰酸荧光素）实现对凋亡早期细胞的识别。
• PI（碘化丙啶）：一种核酸染料，无法透过完整细胞膜，但可进入膜破损的细胞（如凋亡晚期细胞或坏死细胞），与 DNA 结合发出红色荧光，用于区分凋亡晚期 / 坏死细胞与活细胞、凋亡早期细胞。

• 活细胞：Annexin V⁻/PI⁻（无荧光）
• 凋亡早期细胞：Annexin V⁺/PI⁻（仅绿色荧光）
• 凋亡晚期细胞：Annexin V⁺/PI⁺（绿色 + 红色荧光）
• 坏死细胞：Annexin V⁻/PI⁺（仅红色荧光，膜完整性早于凋亡被破坏）

二、试剂盒组成（典型配置）

1. Annexin V-FITC：荧光标记的 Annexin V，通常溶于含防腐剂的缓冲液中，避光保存。
2. PI 染色液：高浓度 PI 溶液（需稀释使用），具有潜在毒性和诱变作用，操作时需注意防护。
3. Binding Buffer：含钙离子的缓冲液，维持 Annexin V 与 PS 结合所需的离子环境，避免使用无钙缓冲液（如 PBS）替代。
4. 说明书：包含具体稀释比例、染色时间、操作步骤及注意事项。

三、实验操作关键步骤

1. 细胞收集：贴壁细胞需用胰酶消化（避免过度消化导致细胞膜损伤），悬浮细胞直接离心收集，用冷 PBS 洗涤 2 次以去除培养基成分。
2. 洗涤与重悬：将细胞重悬于 Binding Buffer 中，调整浓度至 1×10⁶ cells/mL，确保细胞状态良好（避免机械损伤导致的假阳性）。
3. 双染反应：每 100μL 细胞悬液中加入 5μL Annexin V-FITC 和 5μL PI，室温避光孵育 5-15 分钟（时间过短可能染色不充分，过长可能导致 PI 非特异性进入活细胞）。
4. 检测：
   • 流式细胞术：孵育后加入 400μL Binding Buffer，1 小时内上机检测，激发波长 488nm，FITC 检测通道为 FL1（绿色荧光），PI 检测通道为 FL2 或 FL3（红色荧光）。
   • 荧光显微镜：滴加染色后的细胞悬液至载玻片，封片后观察，凋亡早期细胞呈绿色，凋亡晚期细胞呈黄橙色，坏死细胞呈红色。

四、应用场景

• 基础研究：探究药物、辐射、细胞因子等对细胞凋亡的诱导或抑制作用。
• 临床检测：评估肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，监测免疫细胞的凋亡状态。
• 毒理学研究：检测化学物质或环境因素对细胞的毒性及凋亡诱导效应。

五、注意事项

1. 避光操作：FITC 和 PI 均易受光漂白，染色及孵育过程需避光，流式检测前样本需置于冰上并尽快上机。
2. 钙离子依赖：Binding Buffer 中的钙离子是 Annexin V 结合 PS 的关键，若缓冲液含钙量不足，会导致染色效率下降。
3. 细胞浓度：过高的细胞浓度可能导致荧光信号叠加，影响结果分析，建议调整至 1×10⁶ cells/mL 左右。
4. 对照设置：需设置空白对照（未染色细胞）、单染对照（仅 Annexin V-FITC 或 PI）用于流式细胞术的荧光补偿调节。