还原型（GSH）检测试剂盒5

2-8℃ 避光

开盖后组份按要求条件保存。

6个月

分光光度计

血浆/组织/细胞

分光光度计

1.分光光度计（对应波长的酶标仪）
2.恒温水浴锅
3.低温离心机
4.电子天平
5.匀浆器或研钵
6.移液器
7.冰盒

1.PBS缓冲液
2.纯水

1.比色皿
2.试管
3.吸头
4.一次性手套

1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
2.建议次测定时先做2-3个样品的本底对照（空白对照），如果样本空白对照与空白管非常接近，则说明样品液中不存在干扰物质，可以不再检测样本本底对照；如果样品空白对照与空白管有显著差异，则在测定每个样本时都需要做样本的空白对照；
3.GSH比较稳定，血液样本以ACD抗凝后冰箱4℃保存，3周内稳定。
4.请尽量使用新鲜的细胞进行测定，而不要使用冻存的细胞进行测定，避免使酶活性下降。
5.轻度溶血样本对GSH测定无影响。
6.全血GSH与吸烟和锻炼成正比。 与乙醇节制程度成反比。成年人全血GSH的参考区间为1.02±0.17mmol/L
7.测定各孔时，各孔温度均需达到室温或25℃，否则影响结果。
8.测定时建议使用412nm，亦可选用405~425nm；
9.动物样品不能立即测定，应先加入GSH提取液匀浆处理，沉淀后去除蛋白质，防止蛋白质所含巯基及相关酶对测定结果产生影响。处理后的提取液可放低温冰箱-70℃保存，10天内有效。
10.为了您的安全和nm健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

1. 配制GSH提取液（1x）：
取一份GSH提取液（3X）加入2份纯水，混匀即可；
2. 配制DTNB显色液：量取50mlDTNB稀释液加入80mgDTNB粉末中，充分溶解即为DTNB显色液；也可使用精密天平称取DTNB粉末，配制成终浓度为1.6%的DTNB显色液；配置好的DTNB显色液2-8℃保存，有效期一个月。现配现用。
3. 配制GSH标准储存液并制作标准曲线：
将GSH标准（1mM）用纯水稀释成0.1mM的GSH标准溶液，即GSH标准（100uM），然后按下表一次加入纯水，GSH检测缓冲液和DTNB显色液，混匀，25℃保温反应10min。以0号管调零，用分光光度计412nm测定各管的吸光度值，以GSH的浓度（uM）为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

4. 样品准备：
a) 红细胞或血浆样品的制备：
请尽量使用新鲜的血液进行测定。
600r/min离心10分钟，沉淀为红细胞，上清为血浆。
对于红细胞，用PBS洗涤两次。取约50ul红细胞沉淀或血浆，加入50ulGSH提取液（1x），充分Vortex振匀。冰浴放置30min，4℃，12000r/min离心20min，取上清用于还原型(GSH)测定。
处理好的红细胞样品最后需用GSH提取液（1x）稀释10倍后进行后续的检测；
对于血浆样品，应直接取样进行检测。
b) 动物组织样品的制备：
称取0.2g样本于研钵中，加入1ml经4℃预冷的GSH提取液（1x），冰浴条件下研磨匀浆后， 4℃，12000r/min 离心20min，取上清用于还原型(GSH)测定。 并记录上清液的总体积。也可以用液氮研磨匀浆。

c) 细胞样品的制备：
PBS洗涤细胞1次，离心收集细胞，吸尽上清。加入细胞沉淀3倍体积的GSH提取液（1x），充分Vortex振匀。(收集细胞前后分别对离心管进行称重，从而就可以计算出细胞沉淀的重量，10mg细胞沉淀的体积可以粗略地看做10ul。)对样品进行快速的冻融后，4℃或冰上孵育5分钟。4℃，12000r/min 离心20min，取上清用于还原型(GSH)测定。

5. GSH加样操作：
取5ml一次性离心管，按照下表依次加入试剂，混匀并注意避免产生气泡。25℃保温反应10min。1cm比色杯，以空白孔调零，用分光光度计412nm测定各管的吸光度值。
如果样品中的GSH浓度过高，可减少样品用量或者用GSH提取液（1x）适当稀释后再进行测定。

6．计算：
根据还原型（GSH）标准曲线和样品的吸光度值（样品测定孔吸光值-空白对照吸光值），可计算出样品中GSH的浓度（umol/L）和含量（umol/g）

组织细胞样品GSH（umol/g）=C x VT x N /W

式中：
C为从标准曲线上查得的GSH浓度（umol/L）
VT为提取液的总体积（L）
W为样品的质量（g）
N为稀释倍数

1.Xiaobin Li et al.
Astaxanthin reduces type 2 diabetic‑associated cognitive decline in rats via activation of PI3K/Akt and attenuation of oxidative stress
Molecular Medicine Reports 2015