RIPA蛋白裂解液

2-8℃

1.蛋白酶抑制剂未开盖使用前也可以2-8℃储存。开盖使用后-20℃储存。
2.蛋白酶抑制剂从冰箱取出后恢复至室温或37℃短时间水浴，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
3.试剂拆封后请尽快使用完！
 

1年

WB、IP等

细胞、组织

1.使用方便，从细胞，组织中提取蛋白不需经过研磨、反复冻融、超声破碎等前处理。
2.提取过程简单方便，将蛋白提取的时间缩短至30分钟-1小时。
3.含蛋白稳定剂，提取的蛋白稳定。
4.紫外检测蛋白浓度时，背景干扰低。
5.总蛋白提取液含多种有效成分，可以充分释放胞浆蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可结合释出的蛋白防止沉淀。
6.蛋白酶抑制剂抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制剂配方优化。蛋白酶抑制剂混合物包含6种独立的蛋白酶抑制剂AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白酶活性。该混合物优化的组成使其可以抑制几乎所有重要的蛋白酶活性，包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

WB、IP等

1.离心机
2.振荡器
3.涡旋混匀器
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒 7.匀浆机/匀浆器

1.PBS缓冲液 （pH7.4，实验室常用的10mM磷酸缓冲盐溶液（1X）） （phosphate buffer saline/Dulbecco’s PBS：约含8mM Na2HPO4、2mM KH2PO4、137mM NaCl和3mM KCl）
2.蛋白定量试剂盒

 离心管
 吸头
 一次性手套

1.旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。
2.实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
3.蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。
4.如果试剂盒不能短时间内用完，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。
5.可以根据自己实验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。
6.下游实验如果是进行特定蛋白酶或磷酸酶的酶活性检测，提取液可以不加蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂，注意提取过程保持低温操作，缩短离心时间。

A． 细胞裂解
1. 裂解液制备：
每1ml冷的RIPA蛋白裂解液中加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取5-10×106个细胞，在4℃，1000×g条件下离心5-10分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
3. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
4. 每5×106个细胞中加入500 μl冷的裂解液，混匀后，在4℃条件下振荡15-20分钟。
5. 在4℃，12000-14000×g条件下离心10分钟。
6. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，用于下游实验。

B． 组织裂解
1. 裂解液制备：每1ml冷的RIPA裂解液加入2 μl蛋白酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。
2. 取100mg组织样本剪碎，加入1ml裂解液，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体。
3. 将组织匀浆在4℃振荡15-25分钟。
4. 在4℃，12000×g条件下离心10分钟。
5. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，用于下游实验。

上述蛋白提取物可分装后于-80℃冰箱保存备用。

1.细胞裂解速度慢？
为了充分保证提取得到的蛋白的活性，提取液采用独特的保护蛋白的配方，裂解能力温和，下游应用范围广。适当延长裂解的时间即可。

2.蛋白浓度低？
处理部分组织样本时可能没有全部裂解，导致蛋白浓度低。只要适当延长试剂A的处理时间即可。最好在持续振荡的条件下处理，没有振荡器也可间隔几分钟用吸头吹打混匀。

3.用什么方法定量蛋白？
建议用BCA法。不适合用Bradford法，因为试剂A中含有干扰Bradford法的组份，导致定量不准。如果已经进行过透析处理或者用脱盐柱改换过缓冲体系，则可以用Bradford法定量。

4.提取时出现胶状沉淀？
蛋白提取液处理产物中有时会出现少量透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。不检测和基因组DNA结合特别紧密的特定蛋白的情况下，可以直接离心取上清进行后续实验即可；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理，300w/10秒间隔10秒，超声3分钟，随后离心取上清用于后续实验。检测一些常见的转录因子，例如NF-kappaB、p53等时，不必进行超声处理。

5.提取的蛋白具有活性吗？
本试剂盒不含有离子型去垢剂组份，不破坏蛋白的结构，没有对蛋白质之间原有的相互作用的破坏，蛋白均保持其天然构象和活性。

1.An S.J., et al.
Characterization and Functions of Vascular Adventitial Fibroblast Subpopulations
Cell Physiol Biochem 2015 （IF=5.5）

2.Fei Ye, Ting Zhao, et al.
Long-term Autophagy and Nrf2 Signaling in the Hippocampi of Developing Mice after Carbon Ion Exposure
Sci Rep. 2015 （IF=5.228）

3.An S.J. Liu P. Shao T.M. et al.
Characterization and Functions of Vascular Adventitial Fibroblast Subpopulations
Cell Physiol Biochem 2015 （IF=4.652）

4.Lu, Zongliang; Zhou, Rui; Kong, Ya, et al.
S-equol, a Secondary Metabolite of Natural Anticancer Isoflavone Daidzein, Inhibits Prostate Cancer Growth In Vitro and In Vivo, Though Activating the Akt/FOXO3a Pathway
Current Cancer Drug Targets 2016 （IF=3.707）

5.Pin Huan, Hongxia Wang et al.
Identification of differentially expressed proteins involved in the early larval development of the Pacific oyster Crassostrea gigas
Journal of Proteomics 2012 （IF=5.074）