CCK8是一种基于 WST-8 的新型细胞增殖与毒性检测试剂盒，其反应终止液的正确使用直接影响实验结果的准确性和可靠性。以下从作用机制、使用时机、操作规范及注意事项等方面详细阐述关键要点。
一、核心作用与科学原理
CCK8 依赖 WST-8 底物被活细胞线粒体脱氢酶还原为橙黄色甲臜产物的特性实现定量分析。反应终止液通过快速灭活残留的脱氢酶活性，阻断未参与反应的 WST-8 继续转化，从而固定显色强度。若未及时终止，持续产生的甲臜会导致吸光度虚高，造成假阳性结果。
二、精准把控使用时机
1. 时间窗控制：严格按实验方案设定孵育时间后立即加入终止液。以标准 96 孔板为例，建议在培养终点时刻逐孔依次添加，避免因延迟引入误差。
2. 同步化操作：多块板子或大批量样本处理时，可采用排枪同步加样，确保各孔终止时间一致。若需分批次操作，需记录精确的时间差并进行后续校正。
三、标准化操作流程
1. 预混匀准备：终止液使用前需充分颠倒混匀(尤其含结晶成分的配方)，避免沉淀导致浓度不均。部分产品需恢复至室温后再开启，防止低温析晶。
2. 精准配比：根据试剂盒说明书推荐比例添加，常见为每孔加入与培养基等体积的终止液。过量可能导致溶液溢出或影响比色体系；不足则无法全部终止反应。
3. 温和混匀：加样后轻震孔板使液体混合均匀，静置一段时间让颜色稳定后再读数。避免剧烈震荡产生气泡干扰测定。
四、关键注意事项
1. 避光防护：终止后的溶液对光敏感，需尽快完成测读。若需暂存，应用锡纸包裹或转移至避光容器，并在规定时间内完成检测。
2. 温度控制：终止液及反应体系应保持在同一温度环境下操作，温差可能导致体积变化或化学反应速率异常。
3. 污染防控：避免反复吹吸终止液造成交叉污染，推荐使用一次性移液器枪头。若不慎接触皮肤或眼睛，立即用清水冲洗并就医。
4. 废液处理：终止液含潜在生物危害成分，需按实验室规范收集于专用容器，经灭活处理后再丢弃。
五、常见问题规避
- 显色过浅/过深：除细胞数量外，需排查终止液是否失效(过期或储存不当)、添加量是否准确。可设置空白对照孔验证背景值。
- 边缘效应：U 形底 96 孔板边缘孔易因蒸发损失体积，建议外围孔填充 PBS 缓冲液平衡湿度。
- 干扰因素：某些药物或溶剂可能与终止液发生化学反应，此时需优化实验设计或更换检测方法。
CCK8 反应终止液的使用是决定实验成败的关键步骤之一。研究者需严格遵循“及时、准确、一致”的原则，结合试剂盒说明书与实际实验条件优化操作细节。通过规范化操作，可显著提升数据的重复性和可信度，为细胞活力评估提供坚实基础。
