内质网染色试剂盒的使用细节需根据具体试剂类型和实验需求进行调整，以下结合不同试剂盒的特点及操作要点进行详细说明：
一、试剂准备与工作液配制
1. 染料特性与分装：
- 常用探针如E01(蓝色荧光，Ex/Em=373/430nm)、ER Green(绿色荧光，Ex/Em=490/520nm)或ER示踪剂&8482;红(红色荧光，Ex/Em=589/620nm)，需根据实验需求选择。
- 染料母液通常为DMSO溶液，需避免反复冻融。建议使用时分装为小管，每管一次性使用，长期保存需-20℃避光。
2. 工作液稀释：
- 初始稀释：用染料稀释液将母液稀释10倍，再用HBSS缓冲液或培养基进一步稀释50-500倍(贴壁细胞)或20-100倍(需固定/透化的样本)。
- 浓度优化：最终工作浓度需根据细胞类型预实验确定，原则是“至低有效浓度”，避免背景干扰和细胞毒性。
二、细胞染色流程
1. 贴壁细胞染色：
- 预处理：弃去培养基，用HBSS缓冲液轻洗细胞1次，移除残留血清或酚红(可能干扰荧光)。
- 孵育：加入预热的染色工作液(37℃)，覆盖细胞即可。孵育时间15-40分钟，需避光操作。
- 清洗：吸除染液，用新鲜培养基或HBSS洗涤3次，去除游离探针。
2. 悬浮细胞染色：
- 重悬染色：离心弃上清，用预热的染色工作液重悬细胞，37℃孵育15-40分钟[。
- 贴壁辅助：可选多聚赖氨酸处理盖玻片，使细胞贴附后染色，后续操作同贴壁细胞。
三、固定与透化(可选)
1. 固定：
- 用含2-4%甲醛的HBSS或培养基固定细胞10分钟，室温或37℃均可。固定后荧光信号可能部分衰减，需优化固定条件。
2. 透化：
- 去污剂法：0.2% Triton X-100的PBS孵育10分钟，适用于免疫染色(ICC)前处理。
- 丙酮法：预冷丙酮透化5分钟，可降低背景信号，但可能破坏部分膜结构。
四、观察与数据采集
1. 滤光片选择：
- 根据探针调整显微镜滤光片，如FITC通道(绿色)、德州红通道(红色)或自定义波段。
2. 活细胞与固定细胞差异：
- 活细胞染色需快速操作，避免长时间暴露导致探针泄漏；固定细胞可延长观察时间，但需平衡固定造成的信号损失。
五、关键注意事项
1. 操作细节：
- DMSO母液冬季易凝固，需预热至室温并离心回收液体，吸头需预热防止染料吸附。
- 避光操作：探针对光敏感，染色及洗涤过程需尽量减少光照。
2. 兼容性与污染控制：
- 避免与其他品牌试剂混用，防止交叉污染。
- 使用一次性耗材，玻璃器皿需清洗并去除残留清洁剂。
3. 实验优化：
- 浓度与时间：不同细胞膜通透性差异大(如肿瘤细胞vs原代细胞)，需预实验调整染色条件。
- 多色染色：可搭配其他荧光标记(如F-actin绿色、细胞核蓝色)，但需验证探针光谱重叠性。
六、常见问题与解决方案
1. 背景过高：
- 降低探针浓度或缩短孵育时间。
- 增加洗涤次数或改用低吸附耗材。
2. 染色不均：
- 确保工作液覆盖均匀，悬浮细胞需轻柔混匀。
- 贴壁细胞可延长孵育时间至30分钟。
3. 荧光衰减：
- 固定后信号减弱属正常现象，可通过延长成像时间或提高激发强度补偿。
